一、常見實驗異常與處理

擴增抑制問題

· 現(xiàn)象：樣本擴增曲線異常（如H07樣本抑制）。

· 處理：對樣本進行稀釋（建議1:5或1:10），降低抑制物濃度后再復檢。

基線設置異常

· 現(xiàn)象：自動基線設置不合理導致曲線偏移。

· 處理：手動調整基線參數(shù)，將基線結束點設置為擴增信號出現(xiàn)的前一個循環(huán)（如原26改為20）。

無Ct值或信號缺失

排查方向：

· 檢查PCR參數(shù)是否開啟熒光信號采集。

· 驗證模板完整性（避免反復凍融或降解）及引物/探針活性（通過PAGE電泳檢測）。

· 排除設備休眠或電源干擾導致的中斷。

異常擴增曲線

· 斜直線型曲線：檢查分液均勻性（確保反應管液面一致）及反應管氣密性（避免蒸發(fā)）。

· 末尾起跳曲線：

· 若陰性對照出現(xiàn)，提示污染風險（需徹底清潔操作臺及耗材）。

· 若復檢后仍存在，可能是低濃度樣本的非特異性擴增。

二、關鍵操作規(guī)范

樣本處理

· 使用無菌耗材，避免引入外源DNA污染（如氣溶膠）。

· 高濃度樣本需預稀釋，減少抑制劑影響。

反應體系配置

· 嚴格按比例配制Mix，避免酶活性不足或引物過量。

· 分液后檢查八連管液面高度一致性，減少孔間差異。

設備操作

· 上機前確認反應管密封性（按壓管蓋確保無縫隙）。

· 定期校準熒光閾值（建議每月一次），避免基線漂移。

三、污染控制策略

分區(qū)操作

· 嚴格劃分試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴增區(qū)，避免交叉污染。

· 使用帶濾芯槍頭及專用實驗服。

清潔與滅活

· 實驗后使用10%次氯酸鈉擦拭臺面，紫外照射30分鐘滅活殘留核酸。

· 定期更換移液器濾芯及密封圈。

四、實驗記錄與復檢

· 記錄異常曲線特征及處理步驟，建立故障排查檔案。

· 對可疑結果執(zhí)行三次重復實驗，排除偶然誤差。